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Alexa Fluor 488 NHS Ester，即含N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)活化基团的Alexa Fluor 488，可直接与生化分子上的氨基(-NH2)反应形成稳定的酰胺键，主要是伯胺，可用于标记任何含伯胺的蛋白、多肽、氨基修饰的寡核苷酸或者其他含氨基的生物分子。

荧光团	Alexa Fluor 488 dye
活性基团	NHS ester
反应性	伯胺(R-NH2)
分子式	C25H15Li2N3O13S2
分子量	643.4
外观	粉末
Ex/Em	494/517nm
摩尔吸光系数	71,000cm-1M-1
校正因子(CF280)	0.11
结构式

• NHS ester基团对湿度非常敏感，务必干燥保存产品。使用前产品需放到室温回温至少20min。
  
• NHS ester基团的水解发生在水溶性缓冲体系属于竞争性反应。对蛋白/多肽伯胺的连接反应建议在pH7～9范围内进行。
  
• 不要使用任何含伯胺的缓冲液，比如Tris，甘氨酸、铵盐、或其他稳定蛋白如BSA等。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 用1mL不含氨基的合适的缓冲液(eg.100mM碳酸氢钠缓冲液)充分溶解约10mg蛋白。
  注：
  ① 标记的效果具有浓度依赖性，当浓度低于2mg/mL，会严重影响标记效率，标记蛋白浓度需控制在2～20mg/mL。
  ② 标记体系应避免任何含氨基的底物，如Tris、glycine、铵盐、或其他稳定蛋白如BSA等，如待标记的蛋白溶液中含有上述物质的污染，则需透析到10～20mM的磷酸盐缓冲液(PBS)中，再向每毫升蛋白溶液中加入0.1mL 1M碳酸氢盐缓冲液(pH8.3～9.0)调至所需pH值。
  ③ 抗体溶液中存在的微量叠氮钠(＜3mM)或硫汞撒(＜1mM)不会干扰标记反应。
  
• 使用前用高质量无水DMSO溶解Alexa Fluor 488-NHS至10mg/mL。
  注：Alexa Fluor 488-NHS虽然具有水溶性，但是在水溶液中，会被水解成非活性游离酸。因此一旦溶解，该染料活性就可能减弱，尤其是在水溶液中，本品就会变得很不稳定。
  
• 向蛋白样品中缓慢加入50～100μL Alexa Fluor488-NHS试剂，充分混匀。
  注：加入Alexa Fluor488-NHS试剂的量在0.5～1mg。不同的蛋白和标记试剂的标记效果不同，请根据具体情况优化染料与蛋白的比例。
  
• 边搅拌边于室温孵育60min(或更长)；
  
• 利用合适介质去除未反应的试剂；
  
• 测定Alexa Fluor 488-蛋白标记效率(DOL)和标记浓度。
  ① 测定A280和A494：利用1cm路径的比色皿检测标记物在280nm和494nm的吸光值，此处可根据需要对样品进行稀释。
  ② 计算样品中蛋白的浓度：
  

  protein concentration(M)＝	[A280－(A494×0.11)]×dilution factor
  	203,000

  
  ε280 is molar extinction coefficient protein(M^-1cm^-1)at 280nm.ε280 of Alexa Fluor 280 is 203,000.
  CF is a correction factor to account for absorption of the dye at 280nm.CF= A280 free dye/Amax free dye.CF280(Alexa Fluor 488)=0.11.
  Non-IgG proteins will likely have significantly different molar extinction coefficients.
  ③ 计算DOL值：
  

  moles dye per mole protein＝	A494×dilution factor
  	71,000×protein concentration(M)

  
  ε494 is the approximate molar extinction coefficient of the Alexa Fluor 488 dye at 494nm.ε494 of Alexa Fluor 280 is 71,000.